黄芪治疗病毒性心肌炎的分子机制

【摘要】病毒性心肌炎(ViralMyocarditis,VMC)是一种由病毒感染心肌细胞,引起局灶性或弥漫性心肌间质炎性浸润和心肌纤维变性、坏死或溶解的心血管疾病,己成为青少年猝死的主要原因之一,其慢性迁延可发展成为扩张性心肌病(DilatedCardiomyopathy,DCM),其致死率高达50%,而心脏移植是DCM后期唯一的治疗手段,严重危害生命健康。病毒感染是病毒性心肌炎的重要病因之一,其中肠道病毒尤其是B3型柯萨奇病毒(CoxsackievirusgroupBtype3,CVB3)感染引起的病毒性心肌炎最为常见,占发病人数的一半以上。目前,有关病毒性心肌炎的发病机制尚不完全清楚,有研究表明病毒复制可直接引起心肌细胞的损害,但更为主要的是,病毒感染后通过诱生非特异性和特异性免疫应答反应引起大量炎症细胞因子的分泌及炎症细胞的浸润,可导致心肌组织严重的病理损害。迄今,VMC的治疗尚无特异性的治疗方法,常规的治疗方式是应用p受体阻断剂、利尿剂、钙离子通道阻断剂、血管紧张素转移酶抑制剂等普通抗心衰药物来缓解症状和改善心功能。目前也有很多针对VMC特异性治疗的临床研究,例如,研究表明免疫抑制剂咪唑硫嘌啉、强的松、环孢霉素的使用对于急性心肌炎的治疗有一定效果,而静脉注射免疫球蛋白能有效中和病原体以及降低炎症因子的表达,对VMC也有一定的疗效,另外,抗病毒药物干扰素和普拉康纳利的使用也能一定程度地减少心肌的损伤。除了西医之外,中国传统医学一一中医在疾病的临床治疗中发挥着越来越重要的作用,研究表明,中药对于VMC的治疗有着较为显著的疗效,其中黄芪在临床治疗VMC中的应用最为广泛。大量研究证实黄芪能够显著保护心肌和改善心功能。目前,黄芪己被列入我国卫生行政部门制定的有关病毒性心肌炎常规治疗方案中。虽然在临床实践中,黄芪对于VMC的治疗效果己基本明确,但其机制还尚不清楚,为了能够更好的开发黄芪的临床应用价值以及进一步优化VMC的临床治疗策略,本研究我们试图探讨黄芪发挥其治疗功效的可能机制。因此,我们首先观察了黄芪治疗病毒性心肌炎的临床疗效,并检测了黄芪治疗后VMC病人血清中的炎症因子表达谱的改变,观察黄芪是否能调控导致心肌病理损伤的炎症免疫应答,随后利用CVB3诱导的小鼠心肌炎模型进一步探讨黄芪调控病毒感染引起炎症免疫应答的分子机制,以为临床上更好的利用黄芪和筛选治疗VMC的新药提供潜在靶点和实验依据。第一部分黄芪可在临床上有效治疗病毒性心肌炎2011年1月至2011年12月期间复旦大学附属中山医院收治的急性病毒性心肌炎患者60例,参照1995年成人急性病毒性心肌炎诊断标准,病程<3个月,临床表现以心悸、胸闷、气急、胸痛、乏力为主,治疗前均有不同程度心律失常,包括频发各型过早搏动、房室传导阻滞及ST-T改变等心电图表现。病人随机分为黄芪治疗组与常规治疗组,其中黄芪治疗组30例,男性18例,女性12例,平均年龄为31.7±12.9；常规治疗组30例,男性17例,女性13例,平均年龄为32.3±13.6。黄芪治疗组的治疗方式为：黄芪注射液(每支20g/10ml)40g,静脉点滴每日一次,共2周,后改为健心冲剂(其中含生药黄芪15g/包),每日2次,每次1包,连续服用3个月；牛磺酸2g,每日3次口服；泛葵利酮(CoQ10)20mg每日3次口服；抗心律失常药(如普罗帕酮、慢西律、莫雷西嗪、乙胺碘肤酮、双异丙吡胺、索他洛尔、倍他乐克、维拉帕米等)平均疗程3个月；常规治疗组的治疗方式为：极化液(5%葡萄糖500m1+氯化钾10m1+正规胰岛素6U)静脉点滴,每日一次,共2周,后改为维生素C0.2g,每日3次口服,连续服用3个月；泛葵利酮(CoQ10)20mg每日3次口服；抗心律失常药(药物同上)。两组年龄、性别及抗心律失常药物的应用,经统计学处理,无显著性差异(P>0.05),随访6月以上。结果显示,黄芪治疗组中,临床症状得到显著改善的有21例,而常规治疗组只有15例,其中还有两例恶化为慢性扩张性心肌病,表明与常规治疗相比,黄芪治疗后能更有效地改善VMC患者的临床症状。Holter检测心脏早搏数据显示,黄芪治疗后,心脏早搏得到有效改善的共有18例,而常规治疗组中只有9例,显著改善了VMC患者的心脏早搏情况。超声心动图检查结果显示,经黄芪治疗和常规治疗后,患者的射血分数EF(%)均显著提高,而左心室收缩末期内径LVEDs均显著降低,心功能得到有效改善,但是两组之间并无明显差异。心脏组织损伤的血清学指标肌酸激酶同工酶CK-MB和肌钙蛋白cTnI检测结果显示,黄芪治疗组中,所有患者血清中cTnI(100%)的表达都在两周之内转阴,75%患者的CK-MB在两周之内转阴,只有25%的患者CK-MB超过两周的时间转阴,而常规治疗组中分别有40%和54%的患者cTnl和CK-MB的表达在两周以上的时间转阴,提示黄芪治疗组VMC患者心肌损伤恢复时间较常规治疗组短,对心肌组织有着更明显地保护作用。另外,我们还检测了病毒学相关指标CVB-RNA以及CVB-IgM,结果显示黄芪治疗组中CVB-RNA的阴转率明显高于常规治疗组(80%VS50%),提示黄芪治疗能更有效的清除病毒。所有这些结果都确认了黄芪治疗能有效缓解VMC患者的临床症状以及改善患者的心功能,在急性VMC的临床治疗中,显示出比常规治疗更为明显的治疗效果。第二部分黄芪治疗病毒性心肌炎与其调控炎症免疫应答相关一.促炎因子在VMC患者及小鼠模型中显著高表达,并与疾病的严重程度正相关1.促炎因子在VMC患者血清中的表达情况病毒性心肌炎的病理过程以心肌组织大量炎症免疫细胞浸润导致心功能受损为特征,其中促炎因子的分泌表达被认为是介导这一免疫病理过程的重要因素。鉴于此,我们收集了60例VMC患者在接受治疗前的血清,以体检的健康人(HealthyControl,HC)血清作为对照,ELISA检测TNF-α,IL-6,IL-1β以及MCP-1等促炎因子的表达水平。结果显示,60例VMC患者血清中共有38例(63.3%)能够检测到TNF-a的表达(>10pg/ml),最高表达水平可达305.4pg/ml,其平均表达水平为94.18pg/ml,而在健康对照中检测结果均为阴性(<10pg/ml);57例(95%)能够检测到IL-6的表达(>2pg/ml),其最高表达水平可达1240pg/ml,平均表达水平为302.2pg/ml,在健康对照中检测结果均为阴性(<2pg/ml);51例(85%)能够检测到IL-1β的表达(>0.1pg/ml);平均表达水平为59.37pg/ml,健康对照中检测结果也为阴性(<0.1pg/ml);所有的患者血清以及对照健康人血清中都能检测到MCP-1的表达(>7pg/ml),但是VMC患者的MCP-1最高表达水平2064pg/ml,其平均表达水平为392.0pg/ml,而健康对照的平均表达水平为52.52pg/ml,显著高于健康对照(P<0.01)。这些结果表明与健康对照相比,VMC患者中促炎因子的表达显著升高。2.促炎因子在VMC小鼠模型中的表达情况为了进一步分析促炎因子在VMC发病过程中的表达情况,我们利用CVB3诱导的小鼠VMC模型,其具备与人类VMC相类似的病理特征。6W雄性BALB/c小鼠腹腔注射100μl103TCID50CVB3,感染后每天记录小鼠体重,每天取小鼠心脏组织,液氮碾磨,监测炎症细胞因子的动态表达。分别在感染后0,4,7,10天观察小鼠心脏病理变化。结果显示,从CVB3感染后第3天开始,小鼠体重持续降低,生存状态明显变差,毛发竖起,进食减少。心脏组织病理改变结果显示,在感染后第4天,便有炎性细胞的浸润,随着时间的推迟,炎症细胞浸润灶范围逐渐扩大,心脏组织病理损害逐渐增强。而TNF-α,IL-6,IL-1β以及MCP-1这些炎症因子的表达在病毒感染后持续上升,与未感染的正常小鼠相比,其表达量显著升高,并与小鼠体重减轻及心脏病理损伤改变有着几乎同步的变化趋势。3.促炎因子的表达与VMC疾病严重程度的相关性为了进一步确认促炎因子参与了VMC的病理过程,我们分析了它们的表达水平与疾病的病理指标的相关性。结果显示,患者血清中TNF-α,IL-6,IL-1β和MCP-1的表达水平与其心功能分级呈显著正相关(TNF-α,r=0.6834,P<0.0001；IL-6,r=0.5944,P<0.001；IL-1β,r=0.4922,P=0.0002;MCP-1,r=0.4771,P=0.0001),而在小鼠模型中这些促炎因子的表达水平与小鼠体重减轻量(TNF-α,r=0.6414,P=0.0005;IL-6,r=0.6185,P=0.001；IL-1β,r=0.5148,P=0.0085；MCP-1,r=0.6169,P=0.0010)和心脏病理指数也呈明显正相关(TNF-α,r=0.8771；IL-6,r=0.9009；IL-1β,r=0.7935;MCP-1,r=0.8174；allP<0.0001),进一步确认了促炎因子在VMC发病过程及心脏病理损害中发挥了重要的作用,提示调控炎症免疫应答是缓解VMC的有效途径。二.黄芪治疗可调控炎症免疫应答1.黄芪治疗后VMC患者血清中促炎因子的表达改变上述结果表明炎症因子是介导心脏病理损伤的重要因素,为了研究黄芪是否能调控炎症因子的表达,我们检测了VMC患者在治疗后2周以及一个疗程后(3个月以上)患者血清中促炎因子的改变情况。结果显示,两组VMC患者在治疗前,促炎因子的平均表达水平无明显差异,黄芪治疗组中,药物治疗后2周,有10例(33.3%)患者可检测到TNF-α的表达,其平均表达量从96.13±6.14pg/ml下降至30.31±8.09pg/ml;15例(50%)患者可检测到IL-6的表达,其平均表达量从364.6±67.77pg/ml显著下降至39.36±9.011pg/ml;只有5例(16.7%)患者可检测到IL-1β的表达,其平均表达量从15.08±3.49pg/ml下降至5.37±2.49pg/ml;MCP-1的平均表达量从407.0±76.31pg/ml下降至150.8±40.85pg/ml。常规治疗组中,药物治疗后2周,有10例患者可检测到TNF-α的表达,但是其平均表达量与治疗前相比并无显著性差异；仍有20例患者(66.7%)可检测到IL-6的表达,平均表达量为123.3±19.7pg/ml；15例患者(50%)可检测到IL-1β的表达,平均表达量为10.39±1.997pg/ml,与治疗前相比无显著性差异；MCP-1的平均表达量在治疗后2周为267.8±49.39pg/ml,与治疗前的平均表达量376.9±75.29pg/ml相比,无显著性差异。一个疗程之后,所有VMC患者血清中促炎因子的表达都显著下降,TNF-α口IL-1β在黄芪治疗3个月后已经检测不到。这些结果表明,与常规治疗相比,黄芪治疗能在更短的时间内显著下调VMC患者中炎症因子的表达,这与其能在更短时间内使心肌组织损伤恢复相对应,提示黄芪可通过调控炎症免疫应答来保护心肌组织免遭病理损伤。2.黄芪在VMC小鼠模型中对炎症免疫应答的影响我们进一步在VMC小鼠模型中观察了黄芪对于炎症免疫应答的影响,为了后续能更精确地探讨黄芪调控炎症免疫应答的机制,我们在小鼠VMC模型中利用具有清晰化学结构的分子化合物,即黄芪最主要的有效成分黄芪甲甙AstragalosideIV(AST-IV,C41H68O14MW784)。小鼠腹腔注射103TCID50CVB3建立急性VMC模型,之后立即灌胃给予不同药物梯度的AST-IV(20mg/kg/d,40mg/kg/d),感染组对照灌胃给予AST-Ⅳ的溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为Vehicle组,正常小鼠为未感染空白组(Control)。我们分别检测了VMC小鼠中心脏局部及血清中TNF-α,IL-6,IL-1β以及MCP-1等促炎因子的表达,结果显示,与正常小鼠相比,Vehicle小鼠中心脏局部及血清中促炎因子的表达都显著上调表达,而经AST-Ⅳ治疗的VMC小鼠,这些促炎因子的表达都明显下降,并且呈现剂量依赖。免疫组化结果显示CD3+(T淋巴细胞)以及CDllb+(单核细胞／中性粒细胞)的炎性细胞浸润在Vehicle小鼠中显著增强,但AST-Ⅳ治疗后,这些炎性细胞的浸润明显减弱,而高剂量的AST-Ⅳ(40mg/kg)治疗小鼠中,其减弱更加明显,表明黄芪在小鼠VMC中也能显著抑制炎症免疫应答,与临床观察的结果相一致。通过检测小鼠体重减轻率、死亡率、血清学、病理学以及心功能等指标,我们同时也观察了AST-Ⅳ对于小鼠VMC的治疗效果,结果显示,AST-Ⅳ能显著保护小鼠减轻体重,提高生存率,降低血清中CK-MB酶活性和cTnI的水平,石蜡切片H&E染色结果显示,AST-Ⅳ治疗后,炎性细胞的灶性浸润和心肌细胞的片状坏死明显减轻,小鼠心功能超声显示心功能也得到明显改善,表明AST-Ⅳ对小鼠VMC有显著的治疗效果,并且这种治疗效果呈现剂量依赖。综上所述,黄芪治疗病毒性心肌炎与其调控炎症免疫应答相关。第三部分黄芪调控炎症免疫应答涉及NF-κB信号通路NF-κB(nuclearfactor-kappaB)信号通路的激活,能介导大量炎症细胞因子的表达,参与炎症反应等病理过程,因此我们观察黄芪是否是通过抑制NF-κB信号通路调控炎症免疫应答。小鼠腹腔注射103TCID50CVB3建立急性VMC模型,之后立即灌胃给予AST-Ⅳ(40mg/kg/d),感染组对照灌胃给予AST-Ⅳ的溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为Vehicle组,正常小鼠为未感染空白组(Control),CVB3感染4天后,小鼠心脏组织碾磨匀浆,RIPA裂解,WesternBlot检测NF-κB信号通路活化的标志IκBα和p65的磷酸化水平(p-IκBα和p-p65),结果显示Vehicle小鼠中IκBα和p65的磷酸化水平显著上调,而AST-Ⅳ能明显下调二者的磷酸化水平。用ELISA检测核内p65与DNA调控元件的结合力,结果显示AST-Ⅳ能显著下调p65与DNA的结合力,这些结果提示AST-Ⅳ在VMC小鼠中能抑制NF-κB信号通路的活化,从而抑制炎症应答。我们进一步在细胞水平上观察了AST-Ⅳ对于NF-κB信号通路的抑制效应,乳鼠心肌细胞用100μg/mlAST-IV预处理24h,对照则用溶剂二甲亚砜(DMSO)预处理,然后CVB3感染预处理的细胞0,1,2,4,6,8h等不同时间点,RIPA裂解细胞,WesternBlot检测NF-κB信号通路中IκBα和p65的磷酸化水平以及ELISA检测p65与DNA调控元件的结合力,结果显示CVB3感染后1h,就可观察到IκBα的磷酸化,在CVB3感染2h后可明显观察到p65的磷酸化,而经AST-IV预处理后,IκBα口p65的磷酸化水平明显降低,p65与DNA的结合力也显著下降,而细胞分泌的促炎因子的表达也显著受到抑制,我们用CVB3感染小鼠的脾淋巴细胞,也观察到了同样的现象。表明AST-Ⅳ在体外能直接抑制CVB3诱导的NF-κB信号通路的活化。综上所述,在VMC的发病过程中,黄芪能抑制NF-κB信号通路的活化,进而抑制炎症免疫应答。第四部分A20是黄芪调控NF-κB信号通路的潜在靶点一.黄芪可上调A20的表达多聚泛素化在NF-κB信号通路的转导中发挥着非常关键的作用,而去泛素化酶由于可以逆转信号转导分子的多聚泛素化修饰,在信号通路的活化中发挥着重要的负调控作用,目前报道的能使关键信号分子去泛素化从而阻断NF-κB信号通路活化的去泛素化酶有A20,CYLD,USP21,Cezanne,为了确定这些去泛素化酶分子是否参与了AST-Ⅳ对于CVB3诱导的NF-κB信号通路的抑制,我们首先在体外观察了AST-Ⅳ对上述分子的表达影响,乳鼠心肌细胞用AST-Ⅳ(100μg/ml)预处理24h,之后CVB3感染预处理的细胞0,6,12,18,24h,Real-time检测A20,CYLD,USP21,Cezanne等分子的mRNA水平,结果显示,与未经刺激的细胞相比,经AST-Ⅳ处理过的细胞感染后6h,A20,CYLD,USP21,Cezanne的uRNA上调分别表达了9.45,4.44,3.13,1.85倍,A20显著高表达,并在随后的时间内持续维持较高水平的表达,Westernblot结果显示AST-Ⅳ处理后,A20的蛋白表达水平显著升高,并且呈现剂量依赖。我们进一步在小鼠VMC模型中,观察了AST-Ⅳ是否能上调A20的表达,小鼠腹腔注射103TCID50CVB3建立急性VMC模型,之后立即灌胃给予AST-Ⅳ(40mg/kg/d),感染组对照灌胃给予AST-Ⅳ的溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为Vehicle组,正常小鼠为未感染空白组(Control),每天取小鼠心脏组织分别检测A20的mRNA水平和蛋白表达水平,结果发现,AST-Ⅳ处理组小鼠在CVB3感染后第二天,A20mRNA上调表达8.33倍,在感染后第三天达到高峰,并且在感染后第八天仍然维持高表达,其蛋白表达水平也观察到了相同的现象。综上所述,黄芪能显著上调A20的表达,提示A20可能参与黄芪对于CVB3感染诱导的NF-κB信号通路的抑制效应。二.A20通过抑制TRAF6K63泛素化阻断CVB3诱导的NF-κB信号通路1.A20体外抑制CVB3诱导的NF-κB信号通路活化为了研究A20是否能抑制CVB3诱导的NF-κB信号通路,我们分别用腺病毒Ad-A20(Ad-LacZ为对照)过表达A20和用慢病毒LV-shA20(LV-ctrl为对照)下调表达A20。乳鼠心肌细胞用上述腺病毒和慢病毒预处理48h,然后CVB3(MOI=10)感染0,1,2,4,6,8h等时间点,RIPA裂解细胞,WesternBlot检测NF-κB信号通路中IκBα口p65的磷酸化水平以及ELISA检测p65与DNA调控元件的结合力。结果显示,A20过表达能显著抑制IκBα口p65的磷酸化水平、p65与DNA调控元件的结合力以及细胞分泌的促炎因子的表达水平,而A20下调表达后则使IκBα和p65的磷酸化水平增强、p65与DNA的结合力增高、促炎因子表达水平升高。我们在CVB3感染小鼠的脾淋巴细胞中也观察到了同样的现象。表明A20能在生理学水平上抑制CVB3诱导的NF-κB信号通路。进一步我们观察了A20对上游使IκBα发生磷酸化的IKK激酶活力的影响,乳鼠心肌细胞用上述腺病毒和慢病毒预处理48h,然后CVB3(MOI=10)感染0,1,2h等时间点,RIPA裂解细胞,anti-IKKγ免疫共沉淀细胞裂解液,pull-down的蛋白复合物与GST-IκBα37℃孵育2h,WesternBlot检测IκBα磷酸化水平以及IKK-a和IκBα,结果显示,A20过表达能够抑制IKK激酶活力。相反,A20下调表达则能增强IKK激酶的活力,表明A20影响了IKK激酶的活力,进而影响到了下游IκBα和p65的磷酸化。2.A20抑制内源性TRAF6K63泛素化水平而IKK激酶的活化与上游信号分子如TRAF和RIP家族蛋白的K63多泛素化连接有关,这些分子的K63去泛素化连接则能抑制IKK激酶的活化,从而终止下游信号通路的激活。目前报道A20去泛素化的作用靶分子有TRAF6,RIP1,RIP2,那么究竟哪一个分子是A20在CVB3诱导的NF-κB信号通路中作用的靶分子呢?乳鼠心肌细胞用上述腺病毒和慢病毒预处理48h,然后CVB3(MOI=10)感染0,30,60min等时间点,RIPA裂解细胞,分别用TRAF6,RIP1,RIP2抗体免疫共沉淀,WesternBlot检测TRAF6,RIP1,RIP2的K63泛素化水平,以及pull-down后TRAF6,RIP1,RIP2的蛋白表达水平,结果显示,CVB3感染后,只有TRAF6的K63泛素化水平明显增强,而A20过表达则能显著抑制其泛素化,提示CVB3感染后,TRAF6发生K63泛素化,而A20则通过使TRAF6去泛素化,进而抑制下游信号通路的活化。当用慢病毒下调表达A20之后,TRAF6的K63泛素化水平增强了,表明A20在生理水平上抑制内源性TRAF6的K63泛素化,进而抑制NF-κB信号通路的活化。3.A20体内抑制CVB3诱导的NF-κB信号通路活化BALB/c小鼠尾静脉注射50μ1(3×109pfu)腺病毒Ad-A20/Ad-LacZ体内过表达A20,三天后,小鼠腹腔注射100μl103TCID50CVB3,尾静脉注射生理盐水作为感染组对照(Saline),未感染正常小鼠为空白对照(Control),CVB3感染后第4天,取小鼠心脏组织液氮碾磨,RIPA裂解,免疫印迹检测NF-κB信号通路中IκBα口p65的磷酸化水平以及ELISA检测p65与DNA调控元件的结合力。结果显示,Saline小鼠中IκBα和p65的磷酸化水平显著上调,表明CVB3感染后,NF-κB信号通路被活化,而转输了Ad-A20腺病毒即A20过表达的小鼠中,IκBα口p65磷酸化水平显著下降,p65与DNA调控元件的结合力也显著降低,表明在VMC小鼠中A20过表达能抑制CVB3诱导的NF-κB信号通路活化。三.A20对于黄芪抑制NF-KB信号通路至关重要为了研究A20对于黄芪在VMC中抑制NF-κB信号通路的影响,我们在小鼠体内分别过表达和下调表达A20,BALB/c小鼠静脉注射3×109pfu腺病毒(Ad-A20/Ad-LacZ)过表达A202×107nfii慢病毒(TV-shA20/TV-ctrl)下调表达A20,3天后,小鼠腹腔注射103TCID50CVB3,腺病毒注射小鼠灌胃给予AST-Ⅳ20mg/kg/d,慢病毒注射小鼠灌胃给予AST-Ⅳ40mg/kg/d,小鼠感染组对照灌胃给予AST-Ⅳ的溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为Vehicle组,正常小鼠为未感染空白组(Control)。在CVB3感染4天后,取小鼠心脏组织,碾磨匀浆后RIPA裂解,WesternBlot检测NF-κB信号通路中IκBα和p65的磷酸化水平(p-IκBα和p-p65)以及ELISA检测p65与DNA调控元件的结合力。结果显示,在低剂量20mg/kgAST-IV治疗的VMC小鼠中,A20过表达能显著增强AST-IV对于NF-κ3信号通路的抑制,而当A20下调表达后,即使是高剂量40mg/kgAST-Ⅳ处理的VMC小鼠,AST-Ⅳ对于NF-κB信号通路的抑制也被显著减弱。这些结果表明A20对于黄芪在VMC中抑制NF-κB信号通路至关重要。第五部分A20可缓解病毒性心肌炎,并对黄芪的治疗功效至关重要一.A20上调表达能够减轻心肌炎症,并对VMC小鼠有保护作用1.A20对VMC小鼠心肌炎症免疫应答的影响6W雄性BALB/c小鼠腹腔注射100μl103TCID50CVB3,之后感染小鼠尾静脉注射50μl(3×109)表达A20腺病毒(Ad-A20)或者对照腺病毒(Ad-LacZ),感染对照则尾静脉注射50μ1生理盐水(Saline),未感染正常小鼠为空白(Control)。每天记录小鼠的体重改变情况及生存率,感染后7天处死小鼠,取小鼠血液,分离血清用于血清学指标的测定；小鼠心脏一半用于液氮碾磨,碾磨上清用于ELISA检测心脏局部细胞因子的表达,另一半用于甲醛固定,进行心脏组织包埋、切片,HE染色后普通光学显微镜下观察心肌组织病理变化,石蜡切片免疫组化观察心脏组织炎症细胞的浸润情况,流式细胞术分析心脏浸润细胞的比例。结果显示,注射Ad-A20腺病毒的小鼠,心脏组织A20表达水平显著上调,并维持高表达。与对照Ad-LacZ和Saline组相比,Ad-A20组小鼠心脏组织中促炎因子的表达在感染后第4,7,10天都显著下降。免疫组化结果显示,心脏组织浸润的CD3+和CD11b+的炎性细胞都显著减少,进一步用流式细胞术分析浸润细胞的比例,感染小鼠中CD45+,CD3+和CD11b+的细胞数比例显著上调,表明免疫细胞浸润严重,而Ad-A20小鼠中这些炎性细胞的比例均显著下降,表明A20可抑制炎性细胞的浸润。这些结果都表明在VMC小鼠中,上调表达A20可显著抑制心肌炎症。2.A20上调表达对VMC小鼠的保护作用接下来我们观察了A20对VMC小鼠的保护作用,结果显示,Ad-A20能显著保护小鼠减轻体重,提高生存率,降低血清中CK,CK-MB酶活性和cTnI的水平,石蜡切片H&E染色显示,Ad-A20组中的小鼠,炎性细胞的灶性浸润和心肌细胞的片状坏死明显减轻,心脏病理指数也明显降低,表明Ad-A20对VMC小鼠有显著的保护作用。二.A20在黄芪对于VMC的治疗作用中至关重要1.A20在黄芪抑制炎症免疫应答中的作用为了观察A20对于黄芪在VMC中抑制心肌炎症中的作用,BALB/c小鼠静脉注射3×109pfu腺病毒(Ad-A20/Ad-LacZ)过表达A20,2×107pfu慢病毒(LV-shA20/LV-ctrl)下调表达A20,3天后,小鼠腹腔注射103TCID50CVB3,腺病毒注射小鼠灌胃给予AST-IV20mg/kg/d,慢病毒注射小鼠灌胃给予AST-IV40mg/kg/d,小鼠感染组对照灌胃给予AST-IV的溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为Vehicle组,正常小鼠为未感染空白组(Control)。在CVB3感染后第7天,分别检测小鼠心脏以及血清中TNF-α,IL-6,IL-1β以及MCP-1等促炎因子的表达。结果显示A20过表达的VMC小鼠中,其心脏以及血清中促炎因子的表达比单纯AST-Ⅳ(20mg/kg)治疗的小鼠更低,而当A20下调表达之后,其促炎因子的表达比AST-Ⅳ(40mg/kg)治疗的小鼠明显升高。免疫组化检测心脏组织炎性细胞的浸润也显示同样的结果,即A20过表达能增强AST-Ⅳ对炎性细胞浸润的抑制效应,而A20下调表达之后,则明显减弱这一抑制效应,表明A20对于黄芪在VMC中抑制心肌炎症非常重要。2.A20在黄芪对VMC治疗中的作用为了观察A20在黄芪对VMC治疗中的作用,BALB/c小鼠静脉注射3×109pfu腺病毒(Ad-A20/Ad-LacZ)过表达A20,2×107pfu慢病毒(LV-shA20/LV-ctrl)下调表达A20,3天后,小鼠腹腔注射103TdD50CVB3,腺病毒注射小鼠灌胃给予AST-Ⅳ20mg/kg/d,’慢病毒注射小鼠灌胃给予AST-Ⅳ40mg/kg/d,小鼠感染组对照灌胃给予AST-Ⅳ的溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为Vehicle组,正常小鼠为未感染空白组(Control),通过仔细检测体重减轻率、死亡率、血清学、病理学以及心功能等指标评价其治疗效果。结果显示,在低剂量AST-Ⅳ(20mg/kg)给药的小鼠中,A20过表达能够更好的保护小鼠体重减轻、提高小鼠生存率、减轻小鼠心肌损伤及心肌炎症、改善小鼠心功能,而在高剂量AST-Ⅳ(40mg/kg)给药的小鼠中,A20下调表达使小鼠体重减轻增多、降低小鼠生存率、加大小鼠心肌损伤及心肌炎症、小鼠心功能不稳,表明A20下调表达使得黄芪对于VMC的治疗效果显著减弱,A20在黄芪对于VMC的治疗作用中发挥着重要的作用。综上所述,本研究证实了黄芪对于病毒性心肌炎的治疗作用,其治疗效果明显优于常规治疗,并首次揭示了黄芪能够治疗病毒性心肌炎的分子机制,即黄芪通过上调A20的表达,抑制NF-κB信号通路的活化,导致大量致病性炎症因子的下降和炎性细胞浸润的减少,减轻心肌组织的炎症病理损伤,从而使疾病得到改善,并通过改变体内A20的表达水平揭示了A20对于黄芪治疗病毒性心肌炎的功效至关重要。我们的研究可为筛选新的病毒性心肌炎的治疗药物提供一个潜在的靶点,为在分子和细胞水平上更好的分析黄芪或者其他中药的有效药用成分提供了实验依据,对于临床上开拓黄芪的应用价值以及优化病毒性心肌炎的中西医治疗策略有着重要的意义。
【作者】桂俊；
【导师】熊思东；陈瑞珍；徐薇；高波；
【作者基本信息】复旦大学，免疫学，2013，博士
【关键词】病毒性心肌炎；柯萨奇病毒；炎症；NF-κB；A20；

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